ОЦЕНКА ДЛИНЫ ТЕЛОМЕР ПРИ ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ ЧЕЛОВЕКА И УКОРОЧЕНИЕ ДЛИНЫ ТЕЛОМЕР ПРИ ОЦЕНКЕ КЕЛОИДНЫХ РУБЦОВ ЧЕЛОВЕКА

17 июля 2010

Bruna De Felice*, Robert R Wilson and Massimo Nacca
Адрес: Отделение биологических наук, Университет Неаполя II, ул. Вивальди 43, 81100 Казерта, Италия
Email: Bruna De Felice* — bruna.defelice@unina2.it; Robert R Wilson — mondopostino@yahoo.com;
Massimo Nacca — bruna.defelice@unina2.it

Реферат
Область исследования: келоидные рубцы – это доброкачественные опухоли кожи, они являются следствием нарушения регуляции процесса заживления ран у генетически предрасположенных пациентов. Келоидные рубцы характеризуются образованием избыточной рубцовой ткани за пределами раны. Точная этиология по-прежнему неизвестна и в настоящее время отсутствует соответствующее лечение келоидной болезни.

Методы: в данном исследовании мы проанализировали образцы ткани, полученные от 20 больных с келоидными изменениями кожи и образцы нормальной кожи, полученные от 20 здоровых доноров, в качестве контроля. У теломер был измерен теломеро-связывающий фактор (TRF) и ПЦР анализ в реальном времени. Был проведен количественный анализ в реальном времени RT-PCR экспрессии генов hTERT и измерена внутриклеточная выработка активных форм кислорода АФК.

Результаты: В данной работе мы определили, встречается ли у келоидных пациентов уменьшение теломер и экспрессия теломеразной обратной транскриптазы (hTERT). Используя анализ на теломеро-связывающий фактор Terminal Restriction Fragment (TRF) и ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR), мы обнаружили значительное сокращение теломер в 30% келоидных образцов по сравнению с нормальной кожей.

С помощью количественной RT-PCR было обнаружено отсутствие активности теломеразы в келоидных тканях. Кроме того, производство активных форм кислорода АФК в клеточных культурах фибробластов из келоидных образцов, было дольше по времени по сравнению с фибробластами из нормальной кожи.
Вывод: Сокращение теломер обнаружено при нескольких метаболических и сердечно-сосудистых заболеваниях. Мы выяснили, что сокращение теломер, может также быть связано с келоидными рубцами человека. Хронический окислительный стресс играет важную роль в патофизиологии ряда хронических воспалительных заболеваний. Мы обнаружили увеличение производства активных форм кислорода в келоидных фибробластах культуры клеток по сравнению с нормальными фибробластами кожи. Отсюда следует, что окислительный стресс может быть важным модулятором потери теломер в келоидных рубцах из-за отсутствия активной теломеразы, что приводит к укорачению теломер.

История вопроса

Келоидные рубцы (OMIM 148100) являются доброкачественными опухолями кожи, происходящими при заживлении ран у генетически предрасположенных пациентов. Тип наследования наблюдали в 14 родословных с семейным наследованием келоидных рубцов с аутосомно-доминантным режимом [1]. Келоидные рубцы, характеризуются полиферацией кожных фибробластов, избыточным производством компонентов внеклеточного матрикса (ECM), увеличением проникновения воспалительных клеток в том числе лимфоцитов, тучных клеток (ТК) и макрофагов.

Келоидные рубцы распространяются за пределы нормальной кожи и оригинальные границы раны не исчезают спонтанно [2]. Ранее мы показали, что келоидные рубцы отличаются от того, что мы нашли в гипертрофированном шраме тем, что эффекторы р53 и также увеличение экспрессии ΔNp63 могут способствовать келоидному развитию посредством накопления постоянно делящихся клеток [3]. Мы также обнаружили значительное увеличение производства активных форм кислорода в келоидных фибробластах, что, вероятно, связано с воспалением и окислительным стрессом [3]. Целесообразно считать, что отсутствие эффективных методов лечения обусловлено недостаточным пониманием патологии болезни. Это частично объясняется тем, что изучению биологии келоидных рубцов мешает отсутствие четко установленной животной модели этой болезни. Теломеры — это последовательность TTAGGG, которая повторяется на конце хромосомы, и становится все короче с каждой репликацией в соматических клетках. Теломераза обратная транскриптаза, которая синтезирует теломерные последовательности, предотвращает сокращение теломер и тем самым продлевает срок продолжительность жизни клеток. Активация теломеразы определяется экспрессией мРНК теломеразы обратной транскриптазы (hTERT). Этот фермент, который, как известно, играет важную роль в поддержании теломер, присутствует в большинстве раковых и половых клетках, а также в нормальном эндотелии, в то время как активность фермента отсутствует в большинстве нормальных соматических клетках человека [4]. Сообщалось, что оксидативный стресс является важным модулятором потери теломер [5]. Сокращение теломер было обнаружено при нескольких воспалительных заболеваниях, таких как сосудистые заболевания, диабет 2 типа, анемии Фанкони [6-9].

Не располагая данными о длине теломер человека с келоидными рубцами, мы предположили, что у келоидных пациентов более короткие теломеры, по сравнению с контрольными субъектами, и что это будет иметь прямое отношение к маркерам окислительных повреждений ДНК.

Таким образом, целью данного исследования было сравнить длину теломер у пациентов с келоидными рубцами и контрольной группой; кроме того, мы рассмотрели вопрос о возможной роли теломеразы келоидных рубцов в определении экспрессии мРНК теломеразы обратной транскриптазы (hTERT), которая является минимальным компонентом, необходимым для активности теломеразы. Насколько нам известно, это первое сообщение, в котором показано сокращения теломер у человека с келоидными рубцами.

Результаты

Для измерения длины теломер во всех пробах использовали, анализ теломеро-связывающего фактора (TRF) и ПЦР анализ. Среди 20 келоидных пациентов, среднее (+ / — SD) длины теломер была значительно ниже у пациентов с келоидными рубцами (4,12 ± 0,2 Кб) по сравнению с 20 пациентами контрольной группы (6,070 ± 0,6 Кб) (* P <0. 05) (рис.1 и 2). Таким образом, было бы логично предположить, что теломераза обратной транскриптазы, которая удлиняет теломеры посредством синтеза последовательности TTAGGG, обладала большей активностью у келоидных пациентов. Для исследования возможной роли активности теломеразы у человека с келоидными рубцами, мы проанализировали уровень hTERT, методом количественной RT-PCR с использованием пар праймеров специфичных мРНК hTERT келоидной кожи и нормальной кожи. Экспрессию hTERP оценивали на вершине и по краям келоидных рубцов, но уровень был незначительный. Также экспрессию hTert оценивали на вершине и по краям нормальной кожи и не заметили значительной экспрессии. Мы получили культуры фибробластов из 20 образцов келоидной кожи и нормальной кожи, которые использовали в этом эксперименте. Наблюдали увеличение производства активных форм кислорода в культуре фибробластов из келоидных рубцов по сравнению с нормальной кожей. Уменьшенная длина теломер хорошо соотносилась с уровнем активных форм кислорода в фибробластах келоидных рубцов.

Обсуждение

Было показано укорочение теломер у пациентов с наследственными нарушениями дыхательной цепи, синдромом Дауна, сосудистой диментией и атаксией-телангиеэктазией. Последние исследования показывают, что укорочение теломер может являться биомаркером преждевременного клеточного старения при сосудистых заболеваниях и метаболических расстройствах. В нашей работе впервые показано укорочение длины теломер у пациентов с келоидной болезнью. До сих пор является открытым вопрос о корреляции между активностью теломеразы и экспрессией hTERT. У человека, активность теломеразы детектируется в клетках половой линии и злокачественных опухолевых клетках. Теломераза не детектируется в большинстве соматических клеток, за исключением лимфоцитов и эндометрия матки. hTERT является коровым компонентом теломеразы человека, детектируется только в клетках и тканях позитивным по активности теломеразы, но этот компонент не представлен в нормальных соматических клетках с отсутствиет активности теломеразы. Недавно было показано, что в некоторых нормальных тканях, не смотря на отсутствие теломеразной активности, экспрессируется мРНК hTERT. Более того, защитная клеточная функция теломеразы коррелирует с увеличением сопротивляемости апоптозу и увеличением репарации ДНК. Было показано, что окислительный стресс может индуцировать выход hTERT из ядра в цитозоль через ядерные поры.

Длина теломер и её укорочение может стать прогностическим маркером для некоторых форм сердечнососудистых заболеваний, в частности, если окислительный стресс провоцирует развитие данного заболевания. Теломерная ДНК является более чувствительной к окислительным повреждениям, чем весь остальной геном. Интересно, что пациенты с высоким уровнем АФК в связи с дефектами митохондриальной ДНК, так же имеют укороченные теломеры, окислительный стресс так же провоцирует укорочение теломер и потерю функциональности клеток при анемии Фанкони. Более того, клетки пациентов с атаксией-телангиеэктазией проявляют повышенную чувствительность теломерной ДНК к окислительным повреждениям. Последние исследования показывают, что хронический окислительный стресс взаимодействует с поддержанием теломер на двух уровнях: увеличивает базовый уровень укорочения теломер путем индукции повреждений теломерной ДНК, как было показано ранее на фибробластах, с отсутствием теломеразы, а так же предотвращает взаимодействие теломеразы с укороченными теломерами путем индукции её экспорта из ядра и митохондрий; теломераза может быть исключена из ядра параллельно с продукцией АФК. В предыдущем исследовании мы нашли значительное увеличение АФК (активных форм кислорода) в культуре клеток фибробластов от пациентов с келоидными заболеваниями по сравнению с контролем, данное явления, вероятно, связано с воспалительным статусом заболевания. Данные результаты были подтверждены и в нашей работе.

Можно предположить, что окислительный стресс может модифицировать длину теломер в келоидах. С другой стороны укорочение теломер может быть спровоцировано повышенным обновлением и хронической активацией воспалительных клеток. Укорочение теломер может быть как независимым фактором риска келоидов, так и последствие заболевания, так как ускоренное укорочение теломер может обеспечить базу для развития хронического окислительного стресса иили воспаления.
Мы предполагаем, что как и при других воспалительных заболеваниях, окислительный стресс вносит существенный вклад в укорочение теломер при келоидной болезни.

Заключение

В нашем исследовании впервые показана ассоциация между укорочением теломер и келоидной болезнью, с нормализацией на возраст и пол пациентов. Однако для выявления потенциальной роли окружающего (окислительного и др.) стресса в механизмах укорочения теломер при келоидном заболевании у человека требуется дополнительное широкомасштабное исследование.

Методы

Забор образов и выделение ДНК

Все пациенты были мужчинами (25-35 лет), и возраст шрамов составлял от 10 до 12 месяцев. Свежую ткань получали от пациентов с келоидными рубцами, и образцы здоровой кожи получали от здоровых доноров. Все пациенты подписали информированное согласие.

Геномную ДНК выделяли с помощью набора для выделения ДНК для клеток и тканей (Рош, Манхайм, Германия).

Анализ длины TRF

Длину теломер мерили с помощью анализа исследования длины теломер (Рош, Германия) согласно руководству производителя, а также с помощью ПЦР в режиме реального времени.

ПЦР в реальном времени для hTERT

Проводили согласно традиционной методике.

Клеточные культуры

Фибробласты выделяли из образцов кожи и шрамов по методу Лима.

Определение производства АФК

Осуществляли с помощью инкубации клеток в присутствии дихлордигидрофлуоресцеинацетата. Это стабильная нефлюоресцеирующая молекула, способная проникать через мембрану и гидролизуется до флюоресцентного вещества. Клетки загружают этим соединением при 37 гр. Цельсия в стандартной среде. После периода загрузки клетки отмывают фосфатным буфером. Данные анализируют с помощью камеры и программного обеспечения.

Статистический анализ

Статистически значимые различия анализировали с помощью АНОВА анализа. Также мы проводили анализ корреляции Пирсона.

« Предыдущая новость   |  К списку новостей   |  Следующая новость »