Стволовые клетки менструальной крови: выделение, характеристика и дифференцировка

19 мая 2011

А. Пател, Е. Парк, М. Кузман, Фр. Бенетти, Фр. Дж. Сильва, Дж. Алликсон
Кардиологический Центр Клеточной терапии — Институт хирургии сердца, легких, пищевода Университета Питтсбурга, Пенсильвания, США
Медицинский Центр Университета Питтсбурга, Пенсильвания, США
Институт регенеративной медицины Мак Гована, Питтсбург, Пенсильвания, США
Фонд Бенетти, Розарио, Аргентина
Крио-Селл Интернешл, Олдсмар, Флорида, США

Доля стромальных стволовых клеток (СК) многих тканей и органов продемонстрировала свойства СК, таких как возможность самообновления и мультипотентности, что подразумевает мультилинейную дифференциацию. В этом исследовании мы характеризуем популяцию стромальных СК, полученных из менструальной крови (МК). Мы продемонстрировали, что СК МК возможно легко увеличить в количестве для клинического применения и экспрессировать мультипотентные маркеры, такие как Oct-4, SSEA-4 и C-кит на молекулярном и клеточном уровне.

Кроме того, мы продемонстрировали мультипотентность СК МК по направлениям дифференциации. СК МК могут дифференцироваться в хондрогенные, липогенные, остеогенные, нейрогенные, и кардиогенные клеточные поколения. Эти исследования показывают пластичность СК МК для научно-исследовательского потенциала в регенеративной медицине.

ВВЕДЕНИЕ

Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) имеют тотипотентные способности дифференцироваться в любой тип клеток, полученных из всех трех зародышевых листков. Тем не менее, потенциал для тератомы, а также ограниченная доступность ЭСК для крупномасштабного клинического использования, в настоящее время строго ограничивает их для научных исследований. Однако, из-за огромного количества пациентов с множеством заболеваний, дополнительные источники СК с практическим клиническим применением изыскиваются в настоящее время. Было установлено, что многие иные источники СК уже используются в ранней фазе клинических испытаний, включая сердечную недостаточность, травмы спинного мозга, восстановление костей и хрящей.

Фракции стромальных СК многих тканей и органов показали in vitro мультипотентность путем дифференциации в нейрогенные, кардиогенные, остеогенные, липогенные, и хрондрогенные типы клеток. Тот факт, что стромальные СК могут дифференцироваться в эктодермальную и мезодермальную линии подтверждает в дальнейшем их мультипотентность. Тогда возникает вопрос, есть ли источник мультипотентных стромальных СК, из которого можно безопасно их получить в возобновляемый образец, и поддерживать при этом потенциал дифференцировки.

Недавно, стромальные СК были идентифицированы в эндометриальной ткани. Однако, получение непосредственно СК будет очень агрессивной процедурой по отношению к ним. Эндометриальная выстелка матки имеет необыкновенную способность к регенерации. В течение каждого менструального цикла наблюдается огромный рост ткани и кровеносных сосудов, который сбрасывается в конце цикла. В сбрасываемой крови и тканях содержится гетерогенная популяция клеток, в том числе с регенеративной способностью.

Стромальные СК матки имеют схожие мультипотентные маркеры, которые обычно находятся в костном мозге мезенхимальных стволовых клеток (МСК) и могут на самом деле происходит в части из костного мозга. Важные маркеры для определения мультипотентности – это Oct-4 и SSEA-4, как оказалось они эспрессируются во многих мультипотентных и плюрипотентных СК, включая ЭСК, наряду с маркером поверхности клетки c-Kit. Для того чтобы оценить целесообразность получения мультипотентных СК из матки, безопасным и воспроизводимым образом, мы проанализировали излияние менструальной крови и тканей для выявления стромальных СК МК. Мы покажем популяцию СК МК, которые экспрессируют мультипотентные маркеры Oct-4, SSEA-4 и c-Kit, а также их способность быть четко дифференцированными in vitro на несколько клеточных поколений, полученных из мезодермы и эктодермы и способность быть легко воспроизводимыми.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клеточная заготовка и переработка

Эндометриальные менструальные клетки были получены с помощью Divacup, в течение первых нескольких дней менструального цикла. СК МК собирали с осознанного согласия доноров, утвержденных институциональным наблюдательным советом и при подписании информированного согласия. Клетки были транспортированы в фосфатно-солевом буфере (PBS) с пенициллином/стрептомицином и гепарином. Образец поместили в температурный режим +40С до момента обработки в лаборатории в течение 24-48 час. после получения этого образца.

Образец центрифугировали и супернатант отбирали для вирусологического и бактериологического анализа. Затем клетки культивировали на бессывороточных средах.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Рост, экспрессия мультипотентных маркеров и характеристика стволовых клеток менструальной крови

СК МК быстро растут, они увеличиваются вдвое за 24-36 часов; начиная с 50.000 клеток, мы получили 48 млн. клеток на 26 день, они поддерживают диплоидный набор хромосом без аберраций, это определяется кариотипическим анализом. Кроме того, данные ПЦР с обратной транскрипцией показали, что СК МК экспрессируют мультипотентные маркеры Oct-4, но не SOX-2 или Nanog. Анализ проточной цитометрии показал, что СК МК являются маркерами стромальных СК или МСК, таких как CD44+, CD105+, CD166+, CD90+, CD49f+, MHCI, CD29+ и CD9+, а не являются таковыми CD38-, CD133-, CD45-, CD34-, MHC II и LIN. На неопределенном положении находиться диагностика CXCR4, который связан с возвратом в исходное положение СК. Кроме того, анализ проточной цитометрии подтвердил, что СК МК высоко экспрессируют плюрипотентые маркеры SSEA-4 и c-Kit+ (CD117+).

Кроме того, SSEA-4 и c-Kit+ были локализованы на изолированные клоны из СК МК. У культивированных СК МК появляется морфология стромальных клеток. Эти данные показывают, что СК МК являются легко воспроизводимыми и экспрессируют мультипотентные маркеры СК.

Дифференцировка стволовых клеток менструальной крови в мезодермальные линии

Стромальные СК способны дифференцироваться в мезодермальные ткани такие, как хрящи, кости, жировую ткань. СК МК индуцируют липогенную, хондрогенную линии и остеогенную — гистологические характеристики такие как, жировые вакуоли, найденных в адипоцитах (жировых клетках), сульфатированных протеогликанах в виде пятен на хрящах и отложений кальция в костях. Данные показывают, что СК МК дифференцируются в мезодермальные ткани в той или иной степени; 40-50% СК МК дифференцированы в хондрогенную линию; 60-70% — в липогенную и 45% — в остеогенную, все по аналогии с МСК костномозгового происхождения.

Дифференцировка стволовых клеток менструальной крови в нейронные линии

Для того чтобы продемонстрировать пластичность СК МК, мы дифференцировали клетки, происходящих от эктодермальных линий и как следствие экспрессию их клеточных и молекулярных маркеров. СК МК поместили в среду, содержащую FGF на 4 дня с последующим добавлением FGF, PDGF и EGF в течение 7 дней, затем культивировали в FGF и PDGF за исключением EGF в течение 5 дней клетки экспрессировали олигодендроглиальные маркеры O4 и GalC, маркер зрелых нейронов Map-2 и Vimentin. Клетки также экспрессируют маркер астроцитов GFAP.

Данные, полученные методом ПЦР с обратной транскрипцией, подтверждают данные, полученные иммуноцитохимией, которые утверждают, что СК МК экспрессируют несколько нейронных маркеров на уровне РНК, включая Nestin, NCAM, и Nurr-1. Эти данные показывают пластичность СК МК и потенциал дифференциации в несколько нейронных фенотипов в размере 45-50%, что аналогично МСК костного мозга.

Дифференцировка стволовых клеток менструальной крови в кардиогенную линию

СК МК можно дифференцировать в клетки сердечной линии с использованием двух различных методов. Иммуноцитохимия продемонстрировала положительное окрашивание маркера для сердечного актина, тропонина и коннексина 43, когда клетки дифференцированы с использованием либо 8 M Aza, либо 800 M SNAP. Данные, полученные методом ПЦР с обратной транскрипцией, подтверждают выводы иммуноцитохимии, доказывая, что дифференцированные СК МК экспрессируют сердечные маркеры на уровне РНК. Эти данные подтверждают, что СК МК экспрессируют кардиогенные маркеры на клеточном и молекулярном уровне в пределах 50-60%, что аналогично МСК костного мозга.

Оценка длины теломер и теломеразной активности стволовых клеток менструальной крови

СК МК содержит более 50% теломеразной активности и длины теломер, при их сравнении с ЭСК человека, которые намного лучше, чем МСК костного мозга.

ОБСУЖДЕНИЕ

Стромальные СК, как было показано, имеют большой потенциал для будущего использования в клинической трансплантационно-регенеративной терапии. Мы представили популяцию стромальных СК, выделенных из менструальной крови человека. СК МК характеризуются как на клеточном, так и молекулярном уровне, а также имеют возможность быть легко воспроизводимыми и дифференцированными. Это исследование демонстрирует, что СК МК являются уникальной популяцией клеток, которая может быть безопасно выделена и которая может обеспечить воспроизводимым источником СК, путем забора крови у женщин детородного возраста.

Экспрессия мультипотентных маркеров Oct-4, SSEA-4 и c-kit (CD117+) в СК МК не является общепринятой в большинстве популяций взрослых СК. Мы выделили клоны с положительной колокализацией c-kit и SSEA-4. Эта уникальная популяция СК МК отличается от одной из недавно описанных авторами Кюи и др. (2008). Они выделили СК МК с такими маркерами как CD13, CD29, CD44, CD54, CD55, CD59, CD73, CD90, CD105, MHC-I и не выделили CD14, CD31, CD34, CD45, CD50, c-kit, CD133, MHC-II. СК МК имеют мультипотентные маркеры.

Таким образом, это может быть истолковано так, что СК МК распространенная версия эндометриальных СК, которые могут быть легко собраны неинвазивным способом. Экспрессия мультипотентных маркеров свидетельствует о том, что клетки, которые способны дифференцироваться в клетки различных типов, получают из нескольких зародышевых слоев. Транскрипционные факторы Oct-4 и SSEA-4 являются маркерами, которые экспрессированы ЭСК человека и которые также хорошо экспрессируются в наших СК МК. Они могут объяснить быстрое воспроизведение клеток. Они также могут объяснить способность быть направленно дифференцированными в некоторые типы клеток. Дифференциация типов клеток демонстрирует пластичность СК МК и тот факт, что клетки являются не только фенотипическими маркерами клеточной поверхности, как это увидели с помощью проточной цитометрии и иммуноцитохимии, но и могут экспрессировать РНК.

Необходимость регенеративной терапии в том, чтобы включать СК МК, которые обладают способностью внедряться (прививаться) и дифференцироваться огромна. Тем не менее, будет существовать возможность использовать «идеальную» клетку аллогенными способами. МСК, полученные из костного мозга в клинических испытаниях, в последнее время демонстрировали безопасность и эффективность на животных моделях для аллогенного использования в связи с их иммуносупрессивными свойствами. Из-за удобства сбора и выделения СК МК будет большим потенциальным источником мультипотентных клеток, так как они обладают вышеуказанными свойствами.

В настоящее время мы оцениваем возможность использования СК МК человека in vivo для нейродегенеративной и сердечно-сосудистой регенеративной терапии на животных моделях. Мы также находимся в процессе определения гетерогенной смеси типов клеток найденных в менструальной крови и оцениваем лучшее средство, чтобы выделить и культивировать чистые популяции СК МК.

Кроме того, мы также выполняем дальнейшие исследования, беря образцы от разных доноров, для определения воспроизводимости и эффективности мультипотентного дифференцированного потенциала этих клеток. Таким образом, наше исследование показывает, что уникальная и раннее не существовавшая популяция стромальных СК может быть собрана, выделена, характеризована, воспроизводима и отличима от менструальной крови человека.

Литература.

Amit N. Patel, Eulsoon Park, Michael Kuzman, Federico Benetti, Francisco J. Silva, and Julie G. Allickson. Multipotent Menstrual Blood Stromal Stem Cells: Isolation, Characterization, and Differentiation // Cell Transplantation. — Vol. 17., 2008. — P.303–311.

« Предыдущая новость   |  К списку новостей   |  Следующая новость »